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数字PCR之“分”而治之微孔反应体积稳定性对DPCR定量结果的影响

更新时间:2022-10-12  |  点击率:477

转自罗氏诊断生命科学公众号

  


大家好,本堂课我们继续分析“分"而治之,谈谈微反应体积的稳定性及准确性对dPCR定量结果的影响。


dPCR检测反应体系中模板的拷贝数浓度是根据以下公式计算【1】:

Tc=−ln (1 − p)/Vp

Tc:反应体系中模板分子的拷贝数浓度(copy/µL)

p:阳性纳米微孔的比例,Vp是微反应的体积【2】。


如图1所示,当微反应体积存在差异,而这种差异又被忽略的情况下,p值会偏低,导致dPCR的结果也偏低,尤其在整个反应体积中模板浓度比较高的情况下,影响更大;反之当原反应体系中模板浓度足够低,或者有足够的微反应数量能 每个纳米孔的单分子占有率,微反应体积偏差可以被忽略【3】。由此得知,微反应体积是影响dPCR检测结果准确性的又一重要因素。

 

图1 纳米微孔体积变化对分区间样品分布的影响示意图

(来源:罗氏诊断整理


如何控制微反应的体积偏差,

dPCR检测结果的准确性?


首先要选择更稳定的分区方式。

微反应的形成主要有以下两种方式:微滴式dPCR(ddPCR)和芯片式dPCR(dPCR)。

微滴式dPCR是将两种互不相溶的液体的其中一种作为连续相(油),另外一种作为分散相(水),在水/油两相表面张力和剪切力共同作用下分散相以微小体积单元的形式存在于连续相中,从而生成液滴实现多单元独 扩增。这种方式具有成本低,容易实现的优点,在早期推出的dPCR平台上被广泛应用。但这种方式的局限性就在于微滴的均一性以及微滴之间的相互干扰直接影响微反应单元的数量以及微滴体积的准确判断,即使是同类型的微滴发生器之间形成的微滴体积也会存在明显差异【4】【5】。如果在分析的过程默认微滴体积是个固定值,微滴式dPCR 定量结果与使用真实微滴体积计算的浓度之前有明显差异【2】。



芯片式dPCR是通过芯片设计将纳升液体封闭在高通量的微孔或微量通道中进行后续的PCR扩增及扩增后结果的荧光判读。芯片式dPCR生成的反应微孔是物理分区,体积均一,具有较高的稳定性,体系之间影响较小, dPCR定量结果的准确性和稳定性。



但上述两种分区方式不论哪一种,微孔反应体积的偏差都不容忽视【6】【7】,因为样品的前处理方法、检测反应的体系等因素都会引起微孔反应体积的差异。




因此, dPCR检测结果的准确性的第二要素是监控及校准微反应体积。

纳米微孔的体积是影响dPCR检测结果的一个关键因素,选择合适的微反应形成方式可以降低微反应体积的偏差。但无论选择哪种方式,实现对微反应体积的监测及校准是 dPCR检测结果准确性的重要因素。因此,dPCR平台自带微反应体积监测及校准功能,才能有效把控微反应体积对检测结果的影响,从而 检测的结果不受微孔体积偏差的影响。



dPCR技术优势已不需要再赘述,面对目前市场上众多的平台选择,如何去筛选适合自身应用的dPCR平台是关键。



  






参考文献:

1. Standardization of nucleic acid tests for clinical measurements of bacteria and viruses. J Clin Microbiol. 2015; 53: 2008–14.

2. Droplet volume variability as a critical factor for accuracy of absolute quantification using droplet digital PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry volume 409, 2017; 6689–6697

3. Considerations for Digital PCR as an Accurate Molecular Diagnostic Tool Clin Chem, Volume 61, Issue 1, 1 January 2015; 79–88.

4. DNA copy number concentration measured by digital and droplet digital quantitative PCR using certified reference materials. Anal Bioanal Chem. 2015; 407:1831–40.

5. Method for measuring the volume of nominally 100 μm diameter spherical water-in-oil emulsion droplets. NIST Spec Publ. 2016; 260-184.

6. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Anal Chem 2012; 84:1003–11.

7. Single molecule detection in nanofluidic digital array enables accurate measurement of DNA copy number. Anal Bioanal Chem 2009; 394:457– 67.



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